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常見(jiàn)的熒光定量PCR檢測方法有哪些?

更新時(shí)間:2023-04-04      點(diǎn)擊次數:1651
實(shí)時(shí)熒光定量PCR,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常見(jiàn)的熒光定量PCR檢測方法有SYBR Green I熒光嵌合法和熒光探針?lè )ā?br />
SYBR Green I熒光嵌合法:
SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結合后, 熒光大大增強。因此, SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關(guān),可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量。SYBR Green I 的最大吸收波長(cháng)約為 497nm,發(fā)射波長(cháng)最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃~55℃~72℃三步法,40 個(gè)循環(huán)。SYBR Green I 的缺點(diǎn):由于 SYBR Green I 沒(méi)有特異性,不能識別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會(huì )結合發(fā)光,對 PCR 反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會(huì )產(chǎn)生熒光,通常本底較高,所以在臨床上使用可能會(huì )有假陽(yáng)性發(fā)生。
 
SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn):SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)是因為其缺點(diǎn)產(chǎn)生,由于它能所有的雙鏈DNA相結合,所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針,通用性較好,并且價(jià)格相對較低。這對科研是很有利的,因此國內外在科研中使用比較普遍。

熒光探針?lè )ǎ?br />探針?lè )ㄍǔJ鞘褂?’端帶有熒光物質(zhì)(如:FAM等),3’端帶有淬滅物質(zhì)(如:TAMRA、Eclipse、BHQ等)的探針進(jìn)行熒光檢測的方法。當探針完整時(shí),5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約,不能檢出熒光。探針的報告基團的發(fā)射波長(cháng)要在淬滅基團的吸收波長(cháng)范圍內。

能用于實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量的方法很多,各有優(yōu)缺點(diǎn),必須根據具體的實(shí)驗用途進(jìn)行選擇。如果用于區別同源性高的序列以及進(jìn)行SNP分型解析等多重PCR檢測,推薦用熒光探針?lè )?,而進(jìn)行除此之外的Real Time PCR實(shí)驗,我們推薦使用簡(jiǎn)單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。
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